Τα φυτά δεν χρησιμοποιούν όλο το φως που αναχαιτίζεται από τα φύλλα.

Ένα μέρος του φωτός χάνεται ως θερμότητα και το υπόλοιπο εκπέμπεται πίσω ως φθορισμός σε διάφορα μήκη κύματος. Οι αναλογίες φθορισμού σε διαφορετικά μήκη κύματος χρησιμοποιούνται στην έρευνα, τη γεωργία ακριβείας και τη δασοκομία για την ανίχνευση βιοτικών και αβιοτικών στρες που υφίστανται τα φυτά.

Τι είναι ο Φθορισμός
Όταν τα υλικά απορροφούν φως ενός συγκεκριμένου χρώματος και εκπέμπουν φως ενός άλλου χρώματος, αυτή η διαδικασία ονομάζεται φθορισμός. Το φως που εκπέμπεται πίσω έχει λιγότερη ενέργεια από το απορροφούμενο φως λόγω της απώλειας ενέργειας κατά τη διαδικασία. Τα φυτά και τα ζώα μπορούν να φθορίζουν και το χρώμα που εκπέμπεται εξαρτάται από τις ενώσεις που εμπλέκονται.

Ο φθορισμός που παρατηρείται συνήθως στα φυτά είναι ο φθορισμός χλωροφύλλης. Η χλωροφύλλη φθορίζει κόκκινο και πολύ κόκκινο φως, ανάλογα με την ποσότητα φωτός που παραμένει αχρησιμοποίητη από τη φωτοσύνθεση. Επειδή πολλές καταπονήσεις επηρεάζουν άμεσα ή έμμεσα τη φωτοσύνθεση, ο φθορισμός χλωροφύλλης έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως ως δείκτης της υγείας και της παραγωγικότητας των φυτών. Ωστόσο, τα φυτά φθορίζουν επίσης μπλε και πράσινο φως, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες στρες.

Φθορισμός χλωροφύλλης
Ο φθορισμός χλωροφύλλης (ChF) είναι το φως που εκπέμπεται από τη χλωροφύλλη α στους χλωροπλάστες που εμφανίζεται στον ιστό μεσόφυλλου των φύλλων. Η χλωροφύλλη α υπάρχει και στα δύο φωτοσυστήματα, PS I και PS II, όπου απορροφά φως στα 700 nm και 680 nm, αντίστοιχα.

Δύο τύποι αναλογιών φθορισμού χλωροφύλλης χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση του στρες και της υγείας των φυτών. Αυτοί είναι ο λόγος Fv/Fm και ο λόγος κόκκινου προς πολύ κόκκινο.

Η αναλογία Fv/Fm : Στο σκοτάδι, όταν δεν προσπίπτει φως στα φύλλα, ο φθορισμός από το PSII είναι στο ελάχιστο ή F0. Όταν τα φύλλα εκτίθενται σε παλλόμενο φως, ο φθορισμός φτάνει στο μέγιστο Fm. Η διαφορά μεταξύ F0 και Fm δίνει την τιμή Fv. Η αναλογία Fv/Fm υποδεικνύει τον ρυθμό φωτοσύνθεσης. Είναι υψηλός στα υγιή φύλλα και μειωμένος υπό καταπόνηση. Ως εκ τούτου, αυτή η αναλογία χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της φωτοσυνθετικής αποτελεσματικότητας και επίσης για την ένδειξη του στρες.

Η αναλογία κόκκινου προς πολύ κόκκινο : Ο φθορισμός χλωροφύλλης σε κόκκινο χρώμα ή 687 nm εμφανίζεται στο PSII, και ο φθορισμός πολύ κόκκινου χρώματος ή 760 nm εμφανίζεται στο PSI. Όταν τα φύλλα δέχονται στρες, γενικά, η χλωροφύλλη φθορίζει περισσότερο κόκκινο φως επειδή η φωτοσύνθεση συμβαίνει λιγότερο συχνά, αυξάνοντας την αναλογία κόκκινου προς πολύ κόκκινο.

Εφαρμογές του φθορισμού χλωροφύλλης
Οι δύο τεχνικές φθορισμού χλωροφύλλης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση του στρες των φυτών που προκαλείται από ξηρασία, παγετό, ψύξη, έλλειψη θρεπτικών συστατικών, αλατότητα, όζον, ρύπανση από βαρέα μέταλλα, μυκητιακές και ιογενείς ασθένειες, τραυματισμούς και υπεριώδη ακτινοβολία. Η έγκαιρη ανίχνευση του στρες των φυτών είναι δυνατή χρησιμοποιώντας αυτές τις αναλογίες στη γεωργία ακριβείας και τη δασοκομία, ακόμη και πριν εμφανιστούν οπτικά συμπτώματα, συμβάλλοντας στη διατήρηση της υγείας και της παραγωγικότητας των φυτών.

Έλλειψη θρεπτικών συστατικών: Το άζωτο είναι απαραίτητο για τον σχηματισμό χλωροφύλλης. Ως εκ τούτου, η έλλειψη αζώτου θα επηρεάσει αρνητικά τη φωτοσύνθεση και μπορεί να ανιχνευθεί από αλλαγές στην αναλογία Fv/Fm. Εφαρμόζεται στη γεωργία ακριβείας για την παροχή πληροφοριών σχετικά με τις ανάγκες σε άζωτο ανά τοποθεσία, συμβάλλοντας στη μείωση της υπερβολικής χρήσης χημικών λιπασμάτων.
Υδάτινο στρες: Το υδατικό στρες των φυτών μειώνει τον ρυθμό φωτοσύνθεσης, ο οποίος μπορεί να ανιχνευθεί με τον φθορισμό της χλωροφύλλης. Ωστόσο, ο λόγος Fv/Fm δεν είναι πολύ ευαίσθητος σε σοβαρό υδατικό στρες. Ο λόγος κόκκινου προς πολύ κόκκινο είναι χαμηλός, υποδεικνύοντας έλλειμμα αέρα-νερού και όχι έλλειμμα εδάφους-νερού. Επομένως, ο φθορισμός χλωροφύλλης δεν είναι κατάλληλος για καθοδήγηση άρδευσης στη γεωργία.
Ασθένειες: Ο φθορισμός της χλωροφύλλης μπορεί να ανιχνεύσει και να ποσοτικοποιήσει τη συχνότητα εμφάνισης ασθενειών και τις ζημιές που προκαλούνται από διαφορετικούς βιοτικούς παράγοντες στρες.
Θερμοκρασιακή καταπόνηση: Τόσο οι υπερβολικές όσο και οι χαμηλές θερμοκρασίες επηρεάζουν τα φυτά. Σε υψηλές θερμοκρασίες, η φωτοσυνθετική δραστηριότητα μειώνεται, με αποτέλεσμα χαμηλή αναλογία Fv/Fm. Η αναλογία κόκκινου προς πολύ κόκκινο έχει επίσης χαμηλή θερμική καταπόνηση. Οι χαμηλές θερμοκρασίες μειώνουν την αναλογία Fv/Fm, υποδεικνύοντας καταπόνηση ψύξης και κατάψυξης, αλλά αυξάνουν την αναλογία κόκκινου προς πολύ κόκκινο.
Τοξικότητα ζιζανιοκτόνων: Η χρήση χημικών ζιζανιοκτόνων μεταβάλλει τον μεταβολισμό των φυτών, επηρεάζοντας άμεσα ή έμμεσα τη φωτοσύνθεση και τους λόγους φθορισμού. Η εφαρμογή υπερβολικής ποσότητας ζιζανιοκτόνων μπορεί να αυξήσει σημαντικά την αναλογία φθορισμού χλωροφύλλης από κόκκινο προς πολύ κόκκινο.
Αλατότητα : Η αλατώδης καταπόνηση μειώνει και μεταβάλλει τη χλωροφύλλη στα φύλλα επηρεάζοντας την αναλογία φωτοσύνθεσης. Έτσι, η αναλογία κόκκινου προς πολύ κόκκινο αυξάνεται.
Οι αλλαγές στην αναλογία κόκκινου προς απώτερο κόκκινο φθορισμού χλωροφύλλης μπορούν να μετρηθούν σε κλίμακες πεδίου και τηλεπισκόπησης.

Μπλε-πράσινος φθορισμός
Τα φυτά εμφανίζουν επίσης κόκκινο (690 nm) και πολύ κόκκινο (740 nm) φθορισμό ως απόκριση στο υπεριώδες (UV) φως, και το φαινόμενο είναι συχνό στα δικοτυλήδονα και στις περιοχές χωρίς φλέβες ενός φύλλου, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1. Οι ενώσεις που εμπλέκονται είναι και πάλι η χλωροφύλλη α στους χλωροπλάστες· βλ. Πίνακα 1.

Ο κόκκινος και ο πολύ κόκκινος φθορισμός είναι έντονος στα ανοιχτό πράσινα φύλλα. Καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση χλωροφύλλης, η εκπομπή στα 690 nm (κόκκινο) μειώνεται λόγω της επαναπορρόφησης από τις πρωτεΐνες χλωροφύλλης στη θυλακοειδή μεμβράνη, μειώνοντας έτσι την αναλογία κόκκινου προς πολύ κόκκινο. Έτσι, η αναλογία κόκκινου προς πολύ κόκκινο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της περιεκτικότητας σε χλωροφύλλη στα φύλλα.

Σχήμα 1: «Φάσμα εκπομπής φθορισμού ενός φύλλου καπνού χρώματος aurea-green (άνω πλευρά φύλλου) που διεγείρεται από ακτινοβολία UV-A (λ =355 nm) σε φασματοφθορόμετρο Perkin-Elmer. 

«Οι ζώνες φθορισμού στην μπλε (F440), πράσινη (F520), κόκκινη (F690) και πολύ κόκκινη (F740) φασματική περιοχή σημειώνονται εδώ ως μαύρες ράβδοι», Lichtenthaler (2021). (Πίστωση εικόνας: DOI 10.32615/ps.2021.020)

Όταν χρησιμοποιείται ακτινοβολία UV-A, δεν διεισδύει στον ιστό των φύλλων. Οι ενώσεις στα επιδερμικά κύτταρα απορροφούν φως και φθορίζουν. Αυτές έχουν τα χρώματα πράσινο και μπλε. Υπάρχει μια ευρεία μπλε ζώνη που ξεκινά από τα 430 έως τα 445 nm, με έναν κάτω ώμο στα 520 έως 530 nm (πράσινο), όπως φαίνεται στο Σχήμα 1. Ο μπλε και ο πράσινος φθορισμός είναι πιο σταθερός από τον μεταβλητό κόκκινο και τον πολύ κόκκινο φθορισμό που βασίζεται στη χλωροφύλλη.

Στα δικοτυλήδονα, όπου το φως απορροφάται από τους χλωροπλάστες, η εκπομπή μπλε και πράσινου είναι χαμηλή. Αυτό το φαινόμενο έχει επίσης ως αποτέλεσμα τη διαφορά στον φθορισμό μεταξύ των δύο πλευρών των φύλλων. Υπάρχει λιγότερος φθορισμός στο κόκκινο, μπλε και πράσινο φως στις άνω πλευρές των φύλλων του δικοτυλήδονου, τα οποία έχουν περισσότερη χλωροφύλλη. Υψηλότερος κόκκινος και μπλε φθορισμός παρατηρείται από την κάτω πλευρά των φύλλων, λόγω της παρουσίας λιγότερης χλωροφύλλης.

Αντίθετα, στα μέλη των Poaceae και στις φλέβες και τις μεσαίες φλέβες χωρίς χλωροφύλλη, ο μπλε-πράσινος φθορισμός είναι υψηλότερος από ό,τι στα δικοτυλήδονα. Οι ενώσεις που φθορίζουν μπλε και πράσινο είναι τα κινναμωμικά οξέα, το p-κουμαρικό οξύ και το φερουλικό οξύ, που υπάρχουν στο κυτταρικό τοίχωμα και τα κενοτόπια στο κυτταρικό πλάσμα, όπως παρατίθενται στον Πίνακα 1. Το φωσφορικό νικοτιναμίδιο-αδενίνη-δινουκλεοτίδιο (NADP), μια ένωση που βρίσκεται στους χλωροπλάστες, και ορισμένες δευτερογενείς ενώσεις που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια του στρες και της γήρανσης, αυξάνουν επίσης τον μπλε-πράσινο φθορισμό.

Σύμφωνα με τον Lichtenthaler (2021), οι μετρήσεις φθορισμού σε ένα μόνο σημείο μπορούν να δώσουν

αναλογίες μπλε προς κόκκινο, μπλε προς πολύ κόκκινο και μπλε προς πράσινο, επιπλέον της αναλογίας κόκκινου προς πολύ κόκκινο, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του στρες των φυτών. Οι αναλογίες μπλε προς κόκκινο και μπλε προς πολύ κόκκινο είναι πολύ ευαίσθητες στο περιβαλλοντικό στρες. Αυτές οι αναλογίες μπορούν επίσης να διαφέρουν μεταξύ των ειδών.

Πίνακας 1: «Χαρακτηριστικά του μπλε-πράσινου και κόκκινου και πολύ κόκκινου φθορισμού χλωροφύλλης», Yadav et al. (2017). (Πίστωση εικόνας: http://dx.doi.org/10.20546/ijcmas.2017.604.068)

Εφαρμογές του μπλε-πράσινου φθορισμού
Ο μπλε-πράσινος φθορισμός μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μη καταστροφική ανίχνευση έλλειψης αζώτου, υδατικού στρες, θερμικού στρες, στρες από έντονο φως, στρες από ζιζανιοκτόνα και βιοτικού στρες.

Ελλείψεις θρεπτικών συστατικών : Όταν λείπουν τα μέταλλα, ειδικά το άζωτο, υπάρχει λιγότερη χλωροφύλλη. Συνεπώς, ο μπλε-πράσινος φθορισμός είναι υψηλότερος, παράγοντας υψηλότερες αναλογίες μπλε προς κόκκινο και μπλε προς πολύ κόκκινο, οι οποίες μπορεί να είναι ισχυρότερες από τις αναλογίες φθορισμού χλωροφύλλης κόκκινου προς πολύ κόκκινο, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2. Ελλείψεις ψευδαργύρου και αζώτου έχουν ανιχνευθεί σε φυτά σιταριού χρησιμοποιώντας αυτήν τη μέθοδο. Καταπόνηση από άζωτο, κάλιο και φώσφορο έχει ανιχνευθεί επίσης σε φυτά ηλίανθου.

Σχήμα 2: «Διαφορές στις αναλογίες φθορισμού μπλε/κόκκινο (F440/F690) και μπλε/υπερκόκκινο (F440/F725), κόκκινο/υπερκόκκινο (F690/F735) και μπλε/πράσινο (F440/F725) σε ένα φύλλο ελέγχου πράσινου καλαμποκιού και σε ένα φύλλο από ένα φυτό καλαμποκιού με έλλειψη αζώτου», Lichtenhaler, et al. (1997). (Πηγή εικόνας: DOI: 10.1109/IGARSS.1997.609078)

Υδάτινη καταπόνηση : Η υδατική καταπόνηση αυξάνει τις αναλογίες πράσινου προς κόκκινο και πράσινου προς πολύ κόκκινο. Ωστόσο, οι αναλογίες μπλε προς κόκκινο, μπλε προς πολύ κόκκινο και μπλε προς πράσινο είναι ισχυρότερες, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. Αυτές οι μπλε αναλογίες είναι επίσης πιο κατάλληλοι δείκτες υδατικής καταπόνησης στα φυτά από τις αναλογίες φθορισμού χλωροφύλλης, οι οποίες δεν είναι κατάλληλες για την ανίχνευση υδατικής καταπόνησης.

Σχήμα 3 : «Διαφορές στις αναλογίες φθορισμού μπλε/κόκκινο, μπλε/υπερκόκκινο και κόκκινο/υπερκόκκινο και μπλε/πράσινο μεταξύ του μάρτυρα (κεντρικά μέρη φύλλων) και των τμημάτων φύλλων που έχουν υποστεί θερμική και υδατική καταπόνηση (πλάγια και χείλος φύλλου) ενός φύλλου καπνού που έχει υποβληθεί σε επεξεργασία στους 40 °C για έξι ώρες», Lichtenhaler, et al. (1997). (Πίστωση εικόνας: DOI: 10.1109/IGARSS.1997.609078)

Σημαντικό: Σε φυτά που εκτίθενται σε έντονο φως, ο μπλε και ο πράσινος φθορισμός αυξάνονται σε σύγκριση με τα φυτά που βρίσκονται σε σκιά. Ο κόκκινος και ο πολύ κόκκινος φθορισμός μειώνονται λόγω της απορρόφησης της υπεριώδους ακτινοβολίας από τις φλαβονόλες που συσσωρεύονται ως απόκριση στην έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία. Ως αποτέλεσμα, οι αναλογίες μπλε προς κόκκινο και μπλε προς πολύ κόκκινο είναι σημαντικά υψηλότερες από ό,τι στους μάρτυρες και είναι κατάλληλες ως δείκτες έντονου φωτός.

Επίθεση από έντομα : Τα φυτά που δέχονται επίθεση από έντομα εμφανίζουν αύξηση στους λόγους φθορισμού του μπλε προς το κόκκινο και του μπλε-υπερκόκκινου πριν παρατηρηθούν οπτικά συμπτώματα.

Στρες από ζιζανιοκτόνα : Η εφαρμογή υπερβολικής ποσότητας ζιζανιοκτόνων μειώνει την αναλογία μπλε προς κόκκινο και μπλε προς πολύ κόκκινο.

Παρόλο που υπάρχει πράσινος φθορισμός, επειδή ο μπλε φθορισμός είναι ισχυρότερος, η αναλογία του προς τον κόκκινο και τον πολύ κόκκινο φθορισμό είναι ένας πιο αξιόπιστος δείκτης στρες. Οι αναλογίες μπλε προς κόκκινο και πολύ κόκκινο είναι επίσης ισχυρότεροι και καλύτεροι δείκτες στρες από την αναλογία κόκκινου προς πολύ κόκκινο φθορισμού χλωροφύλλης. Δείτε τον Πίνακα 2 για λεπτομερείς συγκρίσεις.

Πίνακας 2. «Διαφορές στις αναλογίες φθορισμού μπλε/κόκκινου (F440/F690), μπλε/υπερκόκκινου (F440/F740), κόκκινου/υπερκόκκινου (F690/F740) και μπλε/πράσινου (F440/F520) μεταξύ διαφορετικών τύπων φύλλων, σταδίων ανάπτυξης, καθώς και συνθηκών καταπόνησης και στρες, συμπεριλαμβανομένης της μερικής αναστολής της φωτοσυνθετικής δραστηριότητας. Ο πίνακας βασίζεται στα πολλαπλά αποτελέσματα που ελήφθησαν με απεικόνιση φθορισμού φύλλων και φυτών. (++: ισχυρή άνοδος; +: άνοδος; – -: ισχυρή μείωση; -: μείωση; 0: καμία σημαντική αλλαγή στην αναλογία φθορισμού),» Lichtenthaler (2021). (Πηγή εικόνας: DOI 10.32615/ps.2021.020)

Μέτρηση των λόγων φθορισμού
Στο πεδίο, ο φθορισμός της χλωροφύλλης μπορεί να μετρηθεί μη καταστροφικά χρησιμοποιώντας όργανα όπως το Φορητό Σύστημα Φωτοσύνθεσης CI-340 . Οι εικόνες τηλεπισκόπησης μπορούν επίσης να μετρήσουν τον φθορισμό που προκαλείται από τον ήλιο.

Ο μπλε και ο πράσινος φθορισμός μπορούν να μετρηθούν στο πεδίο χρησιμοποιώντας εργαλεία όπως το CI-710s SpectraVue Leaf Spectrometer της CID BioScience Inc., το οποίο συλλέγει και αναλύει φάσματα σε πραγματικό χρόνο χωρίς καταστροφικές μεθόδους. Το φασματόμετρο μπορεί να χρησιμοποιήσει φάσματα για να υπολογίσει ενσωματωμένους δείκτες, όπως τον Δείκτη Lichtenthaler 1 (λόγος κόκκινου προς μακρινό κόκκινο) και τον Δείκτη Lichtenthaler 2 (λόγος φθορισμού μπλε προς κόκκινο), ή νέους δείκτες που μπορούν να προστεθούν για να καλύψουν τις ερευνητικές ανάγκες, εξοικονομώντας χρόνο και προσπάθεια.

Πηγές

Lang M., Stober F., Lichtenthaler HK: Φάσματα εκπομπής φθορισμού φύλλων φυτών και συστατικών φυτών. – Radiat. Environ. Bioph. 30 : 333-347, 1991. DOI: 10.1007/BF01210517

Lichtenthaler, HK, Subhash, N., Wenzel, O., & Miehé, JA (Αύγουστος 1997). Απεικόνιση με λέιζερ των λόγων φθορισμού μπλε/κόκκινου και μπλε/υπερκόκκινου, F440/F690 και F440/F740, ως μέσο έγκαιρης ανίχνευσης στρες σε φυτά. Στο IGARSS'97. Πρακτικά του Διεθνούς Συμποσίου Γεωεπιστημών και Τηλεπισκόπησης IEEE 1997. Τηλεπισκόπηση - Ένα Επιστημονικό Όραμα για την Αειφόρο Ανάπτυξη (Τόμος 4, σελ. 1799-1801). IEEE.

 Lichtenthaler, HK (2021). Πολυχρωματική απεικόνιση φθορισμού της φωτοσυνθετικής δραστηριότητας και του στρες των φυτών. Photosynthetica , 59 (2), 4-20.

Russel, AP, και Endow, SA (2016). Σχέδιο μαθήματος: Φθορισμός . Ανακτήθηκε από https://www.biophysics.org/Portals/0/BPSAssets/Education/Documents/LessonPlanFluorescence.pdf

Subhash, N., Wenzel, O., & Lichtenthaler, HK (1999). Αλλαγές στην εκπομπή φθορισμού μπλε-πράσινου και χλωροφύλλης και στους λόγους φθορισμού κατά τη γήρανση των φυτών καπνού. Τηλεπισκόπηση Περιβάλλοντος , 69 (3), 215-223.

Yadav, B., Kumawat, C., Verma, AK, Yadav, DK, & Yadav, P. (2017). Απεικόνιση φθορισμού για την παρακολούθηση του στρες των καλλιεργειών: Μια ανασκόπηση. Int. J. Curr. Microbiol. Appl. Sci , 6 , 568-575.